DNA Primer

Primer adalah rantai asam nukleat yang berfungsi sebagai titik awal untuk mensintesis DNA, yang diperlukan untuk mereplikasi DNA karena enzim-enzim yang mengkatalisis proses ini, yaitu DNA polimerase, hanya dapat menambahkan nukleotida yang baru ke rantai DNA yang ada. Polimerase mulai melakukan replikasi dimulai pada akhir 3’ pada primer dan menyalinnya dengan rantai yang berlawanan. Dalam beberapa kasus replikasi DNA alami, primer untuk mensintesis DNA dan replikasi adalah rantai pendek pada RNA. Banyak teknik pada laboratorium biokimia dan biologi molekuler yang melibatkan DNA polimerase, seperti sequencing DNA dan reaksi rantai polimerase (PCR) yang memerlukan primer DNA. Primer ini biasanya pendek, oligonukleotida disintesis secara kimia, dengan panjang sekitar 20 basa, dimana primer melakukan hibridisasi ke DNA target, yang kemudian disalin oleh polimerase.

Sequencing DNA digunakan untuk menentukan nukleotida dalam sebuah untai DNA. Metode penghentian rantai (sequencing dideoksi atau metode Sanger) menggunakan primer sebagai penanda awal untuk reaksi berantai. Dalam PCR, primer digunakan untuk menentukan fragmen DNA yang akan diperkuat oleh proses PCR. Panjang primer biasanya tidak lebih dari 30 (biasanya 18 hingga 24) nukleotida, dan harus mencocokkan awal dan akhir dari fragmen DNA yang akan diamplifikasi. Replikasi ini berlangsung satu sama lain ― perpanjangan satu primer oleh polimerase kemudian menjadi template untuk yang lain, yang kemudian akan menyebabkan peningkatan eksponensial dalam segmen sasaran. Perlu diketahui bahwa primer pada hakikatnya tidak selalu diperlukan untuk mensintesis DNA.

Pasangan primer harus memiliki suhu leleh yang sama pada waktu annealing dalam PCR. Sebuah primer dengan Tm secara signifikan apabila memiliki suhu reaksi yang lebih tinggi daripada suhu annealing, hal ini dapat menimbulkan adanya kesalahan hibridisasi dan akhirnya dapat memperpan-jang di lokasi yang salah sepanjang urutan DNA, sedangkan bila Tm secara signifikan memiliki suhu lebih rendah dari suhu annealing maka dapat dimungkinkan adanya kegagalan annealing.

Urutan primer perlu dipilih untuk DNA tertentu untuk menghindari kemungkinan adanya kesalahan dalam hibridiasi ke urutan yang sama di dekatnya. Sebuah metode yang umum digunakan adalah BLAST dimana semua daerah memiliki kemungkinan untuk menjadi primer. Kedua urutan nukleotida serta primer sendiri dapat dicari dengan menggunakan BLAST. Mengulangi mononukleotida harus dihindari, karena pembentukan loop dapat terjadi dan berkontribusi untuk mengalami kegagalan hibridisasi. Primer seharusnya tidak mudah untuk terjadi anneal dengan primer lain dalam campuran (baik salinan lain yang sama atau primer dengan arah sebaliknya), hal ini dapat menyebabkan produksi ‘primer dimer’ dapat mencemari campuran. Primer juga harus tidak terjadi anneal secara kuat dengan sesamanya yang dapat menghambat annealing dengan DNA template.

Ketika merancang primer dengan menggunakan kloning TA, efisiensi dapat ditingkatkan dengan menambahkan AG pada ujung ke 5’ dan 3’. Kebalikan dari primer harus komplemen dari urutan cDNA yang diberikan. Komplemen ini dapat dengan mudah ditentukan.

Sumber:

Stock, S. P., Vanderberg J., Glazer I., dan Boemare N. 2009. Primers development and virus identification strategies. Insecta Pathogens: Molecular Approches and Techniques. CAB International.

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s